Практическая наука меняет будущее

Ляйсан Фанилевна Лябипова родилась и выросла в Альметьевске – нефтяной столице Татарстана. Возможно, именно окружающая среда с ранних лет повлияла на ее интерес к естественным наукам. Биологией увлекалась еще в школьные годы. Особенно нравились темы, связанные с цитологией, зоологией и анатомией. Поэтому поступила на биофак КФУ, где и начался ее настоящий научный путь. С начала 2025 года ведет научную деятельность в лаборатории «Центр аналитической биофотоники и инженерии клеточной поверхности» Института фундаментальной медицины и биологии КФУ.

На втором курсе передо мной встал выбор научного направления и лаборатории. Тяжело было понять, чем именно я хочу заниматься, потому что было огромное множество объектов исследований. И вот на одной из учебных пар руководитель лаборатории, в которой я сейчас веду научную деятельность, Равиль Фаридович ??? рассказывал о проектах, которыми сейчас занимается. Особенно меня заинтересовали нематоды и бактерии, которые питаются нефтью. Я поняла, что именно в таких исследованиях вижу смысл – это не просто теория, а вклад в сохранение природы, в практическую науку, способную изменить будущее.

Увлекательная биофотоника

Один из объектов наших исследований – Caenorhabditis elegans. Это свободноживущая почвенная нематода, размером около одного миллиметра. Она не паразитирует, а питается бактериями и обитает в разлагающейся органике. Благодаря прозрачности тела ее внутреннее строение легко наблюдать под микроскопом, что делает ее удобной моделью для научных экспериментов.

Еще один важный объект – бактерии Alcanivorax borkumensis. Это палочковидные микроорганизмы, которые обитают в морской воде, преимущественно в зонах, загрязненных нефтью. Они питаются углеводородами – алканами, присутствующими в нефти, и тем самым играют ключевую роль в биоочистке водной среды.

В лаборатории мы изучаем, в каких условиях нематоды лучше выживают и как добиться синхронного развития особей – то есть получения животных одного возраста. Сейчас мы используем метод, при котором растворяется кутикула взрослых червей, а оставшиеся яйца дают начало одновозрастному поколению.

Также мы исследуем различные штаммы Alcanivorax borkumensis: определяем, при каких концентрациях нефти и при наличии или отсутствии питательной среды их жизнедеятельность наиболее активна. Эти знания в будущем могут быть применены для биоремедиации – очистки загрязненных нефтепродуктами экосистем.

Биофотоника – это научная дисциплина, изучающая, в числе прочего, методики использования света для получения информации о состоянии биологических объектов. Грубо говоря, любой микроскоп, использующий свет, можно назвать инструментом для биофотоники. А свет бывает разный: есть видимый свет, есть свет определенной длины волны, который получается при использовании светофильтров, задерживающих все лишнее. Есть флуоресцентное свечение специальным образом подкрашенных объектов, которые помогают найти на темном фоне то, что хочет увидеть ученый. Также свет может быть рассеивающийся, под определенным углом преломляющийся об объект, позволяющий увидеть очертания ничтожно малых частиц. Эти принципы лежат в основе микроскопии светлого поля, флуоресцентной и темнопольной микроскопии. Эти инструменты используются казанскими учеными для новых открытий и изучения полезных свойств хорошо известных живых объектов.

Например, при помощи окрашенной флуоресцентным красителем бактерии, которая может разлагать нефтяные пятна, можно легко увидеть, где именно происходит концентрация микроорганизмов и насколько быстро они расселяются. Таким образом был изучен замечательный «тандем»: нематода-бактерия, который оказался эффективным средством борьбы с нефтяными разливами. Практически прозрачный круглый червь, внутри которого также можно обнаружить съеденные им подкрашенные бактерии, способен расселять их на большие площади, увеличивая зону охвата медлительного микроба. К примеру, это может быть актуально для прибрежной акватории, загрязненной мазутом. Бактерии, воспользовавшись таким «транспортом», вступают в дело и расщепляют мазут на составляющие, поедая его по всей площади.

Также при помощи фотометров, то есть приборов, определяющих интенсивность света, можно изучать многие важные аспекты жизни микробов. В 2021–2023 годах исследователи изучали новое многообещающее средство против патогенных бактерий – наночастицы серебра. Для этого большую часть работы проделали, изучая помутнение питательного бульона, при помощи фотометров. Если бактерия чувствует себя хорошо, то среда мутнеет, это означает, что средство не работает эффективно. А если лекарство хорошее, то бульон остается прозрачным, не портится от микробов. Эту мутность легко определить и выразить в числовом эквиваленте – так можно сравнивать совершенно разные лекарства, как бы приводя их к общему знаменателю. Например, было сделано сравнение наночастиц металлов с антибиотиками и фунгицидами. Такие исследования продвигают медицину вперед и позволяют пополнять копилку новых разработок, которая в результате дает принципиально новую терапию.

Но существует и микроскопия, на первый взгляд совершенно не использующая свет – атомно-силовая микроскопия. Здесь используется принцип «ощупывания» – тончайшая игла, или кантилевер, многократно прикасается к поверхности препарата, передавая данные компьютерной программе, которая рисует рельефные изображения – горы, впадины, микротрещины – все, что можно определить наощупь. Кроме того, в каждой точке меряется липкость, шероховатость и прочие чрезвычайно важные характеристики объекта, к примеру, клеточной стенки. Но клетку можно не только осматривать и ощупывать – исследователи научились «дорабатывать» клеточную поверхность настоящими инженерными методами. Например, можно встраивать в клеточные мембраны органические и минеральные структуры, наносить покрытия, создавать маркеры и якоря. При помощи таких модификаций изменяются свойства клетки, или она становится заметной для исследователя, или она может начать специфически распознаваться другими клетками, что отправляет ее в путешествие по организму, в строго определенном направлении. Потенциал таких исследований очень большой, например, железные наночастицы с магнитными свойствами, будучи встроенные в поверхностные структуры клетки, позволяют перемещать такую клетку с помощью магнитного поля или нагревать ее до высоких температур, не прикасаясь к ней теплоносителем. Такие методы могут стать ключом к борьбе с раковыми опухолями, так как они позволяют как доставить такого «троянского коня» к опухоли, так и уничтожить ее высокой температурой.

Недавно я стала участницей научной школы «Advanced workshop week», организованной AlmetTech. В рамках проекта мы работали с дрожжевым штаммом Saccharomyces cerevisiae var. Boulardii – это пробиотик, используемый при лечении желудочно-кишечных заболеваний. Он производит антимикробные соединения, конкурирует за питательные вещества с патогенами и препятствует их прикреплению к слизистой кишечника.

Исследование: «Дрожжи-киллеры или поиск подходов, регулирующих микробную адгезию»

Непатогенные дрожжи Saccharomyces cerevisiae var. boulardii обладают рядом полезных для кишечника свойств и таким образом прописываются, как пробиотики, для лечения диареи и желудочно-кишечных заболеваний. Интерес к этому виду неуклонно растет из-за растущей угрозы антибиотикорезистентности, которая возникает в результате активного использования препаратов на основе бактерий.

S.boulardii – действующее вещество лекарственного препарата Энтерол, который применяется при лечении антибиотико-ассоциированной диареи (ААД). Наша работа направлена на изучение параметров культивирования дрожжей, оценку влияния клеточных структур на рост бактериальной культуры, а в перспективе – на разработку технологии для производства собственного аналога пробиотика.

Целью исследования являлось изучение воздействия факторов культивирования на гидрофобность и антимикробные свойства штамма Saccharomyces cerevisiae var. boulardii Y-3925 (Sb).

Перед нами стояли следующие задачи:

• • Оценить антимикробную активность штамма на E.coli при помощи различных методов совместного посева;
  • Определить гидрофобность штамма дрожжей, выращенных на питательных средах различного состава и при различных условиях культивирования;
  • Исследовать антибактериальное действие клеточных стенок, автолизата и экстракта штамма дрожжей на культуры E. Coli.

Схема эксперимента:

Мы посеяли дрожжи в жидкие среды (глюкоза 2 и 6 % и мальтоза 2 и 6 %) и культивировали 24 часа при 30, 35 и 40˚C. Наша задача состояла в том, чтобы определить гидрофобность клеток в зависимости от внешних факторов и свойств штамма.

Гидрофобность клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae – показатель, влияющий на их способность к аутоагрегации, адгезии к различным поверхностям. Так как этот вид дрожжей используется в качестве пробиотиков, они должны обладать следующим свойством – прикрепляться к кишечнику, удерживая патогенные микроорганизмы.

Клетки дрожжей после их роста собрали центрифугированием, дважды промыли раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с концентрацией 30 ммоль/л, дважды дистиллированной водой и ресуспендировали в дистиллированной воде.

Клетки суспендировали в фосфатно-мочевинно-магниевом (PUM) буфере (pH 7,1) в концентрации 5×10⁶ клеток/мл. Суспензии клеток поместили в пробирку и добавили н-гексодекан. Образцы перемешали на центрифуге и дождались полного разделения двух фаз. Водную фазу удалили и начали определять поглощение на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Гидрофобность рассчитывали по уравнению:

H%=1- A0A1×100%,

где A₀ – начальная оптическая плотность суспензии, A₁ – оптическая плотность водной фазы после смешивания.

В результате эксперимента было продемонстрировано, что:

1. Температура культивирования напрямую влияет на структуру и состав клеточной стенки дрожжей, а значит – и на гидрофобность поверхности. При изменении температуры могут меняться соотношение липидов и белков в мембране, уровень насыщенности жирных кислот, а также экспрессия поверхностных белков и полисахаридов.

2. Наличие мальтозы (6 %) при высокой температуре культивирования (40 °C) стимулирует дрожжи на наибольшее повышение гидрофобности – усиленная экспрессия гидрофобных белков и увеличение адгезивных свойств микроорганизма.

3. Наличие мальтозы (2 %) в питательной среде при той же температуре, наоборот, вызывает сильную гидрофильность, что может указывать на стрессовую адаптацию культуры.

Следующим этапом стала оценка антимикробных свойств автолизата.

Готовый автолизат отмыли путем центрифугирования и многократного добавления дистиллированной воды. Таким образом, у нас получились следующие образцы: клеточные стенки, дрожжевой экстракт и сам автолизат.

Дрожжевой экстракт – это водорастворимая фракция, получаемая из автолизированных или разрушенных клеток дрожжей, содержащая богатый набор биологически активных соединений: аминокислоты, пептиды, нуклеотиды, витамины группы B и водорастворимые метаболиты. Получают его путем разрушения клеток (например, автолизом), с последующим удалением нерастворимых компонентов (клеточных стенок).

Автолизат дрожжей – это продукт самопереваривания (аутолиза) дрожжевых клеток, происходящего за счет действия собственных гидролитических ферментов после прекращения активного роста или при разрушении клеточной оболочки. Он содержит как растворимые внутриклеточные компоненты (включая те, что составляют дрожжевой экстракт), так и нерастворимые части, например, фрагменты клеточных стенок.

Анализ проводился в 96-луночном планшете с использованием планшетного спектрофотометра при длине волны 520-600 нм в течение 24 часов при постоянной температуре 37˚C. Измерение оптической плотности выполнялось с часовым интервалом на протяжении всего периода инкубации. Перед каждым измерением планшет перемешивался в течение 20 секунд для обеспечения равномерного распределения микробных клеток в лунках. В каждой лунке планшета были питательная среда, бактериальная суспензия и клеточная стенка/дрожжевой экстракт/автолизат. Изменение оптической плотности, полученное в ходе эксперимента, служило показателем кинетики роста тестируемых микроорганизмов и позволяло оценить антимикробную активность исследуемых образцов (клеточных стенок, дрожжевого экстракта или автолизата).

В ходе эксперимента было установлено, что наибольшую ингибирующую активность проявляет именно автолизат, менее активны дрожжевой экстракт и клеточная стенка. Мы предполагаем, что это связано с тем, что автолизат включает в себя дрожжевой экстракт (растворимые вещества без клеточных остатков) и клеточные стенки, которые вкупе замедляют рост бактериальных клеток.

Также мы проводили визуальную оценку антимикробной активности

Белые колонии – дрожжи, прозрачные – бактерии.

На всех полученных после инокулирования средах прослеживается четкая тенденция S.boulardii подавлять рост E.coli, несмотря на то, что нами поддерживались условия для ее активного роста.

На некоторых чашках можно заметить участки, на которых изначально прорастала E.coli, но затем активно колонизировалась S.boulardii, из чего можно сделать вывод о том, что дрожжи, ввиду недостаточности питательных компонентов, спустя продолжительное время после начала инкубации начинают использовать биомассу погибших E.coli, как источник питательных веществ.

В ходе нашего исследования показано, что температура и тип углевода непосредственным образом влияют на клеточную гидрофобность. А наибольшей способностью ингибировать рост бактериальной клетки обладает автолизат из-за своего комплексного состава (аминокислоты, полисахариды, компоненты цитоплазмы, ферменты).

В перспективе после завершения работ возможно создание конкурентоспособного на российском рынке пробиотика, поскольку на сегодняшний день все аналогичные препараты лишь фасуются на ее территории, но не производятся.

Главное – не останавливаться на достигнутом. Нужно пробовать себя в разных научных направлениях, быть открытым новому и не бояться перемен. Страх – естественная часть пути, но только преодолевая его, можно приблизиться к мечте. Моя цель – заниматься биологией не только ради знаний, но и ради того, чтобы использовать их на благо природы и человека.